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葡萄酒酿造工业上，二氧化硫的加入始终贯穿整个工艺流程。目前工业上一般不通入二氧化硫气体，主要加入6％亚硫酸溶液或焦亚硫酸钾粉末，技术关键是二氧化硫加入的时机和剂量。

原理：K₂S₂O₅＋H₂O→2KHSO₃；HSO₃⁻＋H⁺→SO₂＋H₂O

一、二氧化硫加入的时机与剂量

1、葡萄破碎的同时

葡萄汁接触空气时，氧化酶立即启动褐变，杂菌开始繁殖。必须在氧化和发酵开始前，立即加入二氧化硫，对葡萄汁进行保护。一般二氧化硫的含量控制在30-60ppm。

2、葡萄汁发酵初期

葡萄汁发酵开始24-48t内，根据游离二氧化硫的含量，一般补加二氧化硫20-30ppm。主要作用一是加强抑制杂菌，确保人工酵母成为优势菌群；二是防止发酵初期体系升温，导致氧化加快；三是二氧化硫有助于破坏细胞壁，可促进葡萄色素和单宁等有机大分子浸出。

3、葡萄汁发酵结束

葡萄汁发酵结束并分离皮渣后，立即补加二氧化硫15-25ppm。一保护新酒不被氧化；二保护固定颜色和香味；三抑制乳酸菌。

4、葡萄酒陈酿期间

葡萄酒陈酿期间，定期测量游离二氧化硫的含量，每1-3个月调整1次，控制游离二氧化硫的含量在20-30mg/L。一是继续抗氧化；二是防止杂菌污染酒香酵母。

5、葡萄酒装瓶前

葡萄酒装瓶前1-3天，最后一次调整二氧化硫，控制游离二氧化硫的含量在20-30mg/L。确保葡萄酒装瓶后的稳定性，防止体系中的微量氧气引起葡萄酒变质。

注意：每次加入前必须测量游离二氧化硫的含量，主要是现代仪器法和经典滴定法，经典滴定法包括直接碘量法和电位滴定法。一定要避免超过国家规定，且防止抑制甚至杀灭人工酵母。

二、葡萄汁与空气中氧气的反应

1、生物酶催化下的氧化反应

葡萄汁中含有多酚氧化酶(ppo)，多酚氧化酶的活性中心是两个一定结构环境下的Cu²⁺(与氨基酸残基配合)，活性中心入口有一个“门控”氨基酸残基，负责有选择性的控制底物的进入。

在葡萄破碎和葡萄汁发酵初期，在多酚氧化酶的催化下，空气中的氧气与葡萄汁中的酚类底物(一般红葡萄中的花青素或白葡萄中的黄烷醇)在酶活性中心发生氧化反应，生成邻-醌类物质，邻-醌类物质迅速聚合成褐色的高聚物，俗称“褐变”，导致葡萄汁变色。

2、化学物质催化下的氧化反应

葡萄汁中含有Fe²⁺、Cu⁺等金属离子，空气中的氧气与Fe²⁺、Cu⁺发生芬顿反应，生成O₂⁻、H₂O₂、最终产物为具有强氧化性的-OH。它们与葡萄汁中具有还原性的物质或基团(如醇类、多酚类、萜烯类、醛类、-SH等)发生氧化反应。

❶氧化酯类(果香味)的保护基团，促进酯类的水解或重排。

❷氧化萜烯类(果香味)的结构。

❸氧化含硫氨基酸，生成甲硫醇等具有强烈异味的挥发性有机物。

❹氧化乙醇生成乙醛、乙酸，导致异味。

❺把酚类氧化为醌类，醌类与氨基酸发生降解，生成具有强烈异味的糠醛类物质。

❻把维生素C氧化降解，生成具有强烈异味的糠醛类物质。

三、二氧化硫的抗氧化作用

1、破碎与发酵初期

❶直接耗氧

H₂SO₃、HSO₃⁻直接与O₂反应。

❷抑制多酚氧化酶的活性

SO₂、H₂SO₃、HSO₃⁻与多酚氧化酶活性中心的Cu²⁺直接强配合，使多酚氧化酶的催化活性降低。

2、发酵后期与陈酿

❶拦截氧化中间体，阻断氧化链

(ⅰ)H₂SO₃、HSO₃⁻与O₂⁻、H₂O₂、.OH、ROO.等发生反应。

(ⅱ)HSO₃⁻与乙醛、丙酮酸、糠醛等含羰基物质加成。

❷还原氧化产物

H₂SO₃、HSO₃⁻主要把醌类物质还原为酚类物质。

注意：❶上述作用必须在一定PH环境下进行，二氧化硫本身就具有调节PH的作用。

❷二氧化硫不能过量，过量的二氧化硫一具有毒性；二可能破坏人工酵母；三具有漂白性，可能通过加成破坏色素，故白葡萄汁中二氧化硫含量一般大于红葡萄汁中二氧化硫的含量。

四、葡萄汁发酵过程中，酿酒酵母的有效成分和发生的反应

1、酿酒酵母的有效成分

工业上使用的酿酒酵母是通过一套严谨的“选育-扩培-加工”工艺流程制造的；不同的酿酒酵母适用于不同的水果或粮食，酿酒酵母1012专用于葡萄酒酿造。

酿酒酵母核心有效成分是活性酿酒酵母活菌系统，依靠细胞内全套代谢酶系统(包括糖酵解酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、酯合成酶、甘油合成酶、亚硫酸解毒酶等)完成从糖类到酒精的发酵；细胞内辅酶NAD⁺/NADH、ATP是代谢必需的功能物质，负责传递还原氢和供能，维持代谢循环，依附于酶促反应。

2、葡萄汁发酵酿酒过程中，在酶活中心发生的反应

❶一次发酵：葡萄糖→3-磷酸甘油醛→丙酮酸→乙醛→乙醇。

❷二次发酵：苹果酸→乳酸(酸味)

❸次级发酵：乙醇→乙酸乙酯、己酸乙酯(香味)

❹次级发酵：葡萄糖→磷酸二羟丙酮→甘油-3-磷化→甘油(口感)

五、葡萄汁发酵过程中，杂菌的来源 、种类和危害

葡萄汁发酵过程中，杂菌最主要的来源是原料葡萄，葡萄皮表面附着大量野生细菌；其次酿造环境包括设备、辅料、操作等也能带入各种细菌。

常见的有害杂菌包括危害最大的醋酸菌，通过乙醇→乙醛→乙酸过程使葡萄酒发生醋败；其次是有害乳酸菌(异型发酵乳酸菌)，区别于把苹果酸转化为乳酸的有益乳酸菌，发酵分解残糖、柠檬酸，生成乙酸、双乙酰等，发生醋败和馊味；腐烂葡萄携带的有害霉菌(青霉、灰霉)，分泌毒素，产生霉味，合成多酚氧化酶，加速褐变；酒泥长期静置、PH偏高、二氧化硫不足时，厌氧有害菌分解葡萄酒中的有机酸、甘油等，产生腐臭味；野生劣变酵母能大量把氨基酸转变成具有毒性的高级醇(氨基酸→α-酮酸→高级醚)、H₂S、乙醛等。

六、葡萄汁发酵过程中，二氧化硫的抑菌机理

首先强调只有游离分子态SO₂、H₂SO₃具有抑菌活性，HSO₃⁻、SO₃²⁻几乎没有杀菌能力。

1、穿透杂菌细胞膜是抑菌的前提

游离分子态SO₂、H₂SO₃极性较弱，且属于小分子，不带电荷，因而具有脂溶性，可以自由穿透杂菌细胞的磷脂双分子层细胞膜；带电的HSO₃⁻、SO₃²⁻不能穿透细胞膜，只能留在细胞外。

SO₂、H₂SO₃进入近似中性环境的细胞质后，生成HSO₃⁻、H⁺等，使细胞内酸化，同时富集阴离子，破坏细胞内环境稳态。

2、二氧化硫抑制杂菌的主要反应

❶最主要的反应：HSO₃⁻与杂菌酶活性中心的催化基团巯基(-SH)结合，巯基被封闭，且酶的空间结构改变，因而使杂菌酶失活。

R-SH＋HSO₃⁻→S-S-SO₂＋H₂O

❷使杂菌细胞内PH降低

(ⅰ)细胞生存都有适合的PH环境，酸化直接导致细胞凋亡，酶催化效率降低；

(ⅱ)破坏细胞膜质子动力势，使细菌无法转运葡萄糖、氨基酸等营养物质，导致细胞凋亡；

(ⅲ)细胞需要消耗ATP反向泵出过量氢离子，导致细胞能量透支，最终凋亡。

❸干扰杂菌内核酸、蛋白质的合成，抑制杂菌增殖

(ⅰ)HSO₃⁻与杂菌DNA、RNA中的某些基因加成，阻碍复制、转录，使杂菌不能分裂增殖；

(ⅱ)抑制杂菌中氨基酸活化、多肽链合成，使新蛋白无法合成。

❹HSO₃⁻消耗杂菌细胞内的抗氧化物质，如维生素C、谷胱甘肽等，使杂菌无法抵御氧化损伤，内部代谢紊乱，加速失活凋亡。

七 、酶酒酵母能抵抗二氧化硫的机理

酶酒酵母对二氧化硫有较强的抵抗性，通常在游离二氧化硫200-300mg/L下仍能正常发生反应；而葡萄汁中游离二氧化硫一般控制在20-40mg/L，该环境下，酶酒酵母能稳定存活、增殖；而杂菌则失活、凋亡。

❶酿酒酵母具有比杂菌更坚固的细胞壁屏障；

❷酿酒酵母细胞内含有亚硫酸还原(解毒)酶，能将SO₂ 、H₂SO₃、HSO₃⁻还原为H₂S排出；

❸酿酒酵母细胞内含有发酵生成的乙醛，乙醛快速结合(加成)HSO₃⁻、解除二氧化硫等对酶的抑制作用。